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RNAi基因干扰

时间:2015-12-25 作者:市场部 文章来源: 浏览:3195

RNA干扰整体实验服务—RNAi基因干扰


RNA干扰(RNAi基因干扰、SiRNA实验):RNA干扰(RNA interfering,RNAi)现象是指由与靶基因序列同源的双链RNA(DsRNA)引发的基因转录后的沉默过程,小干扰RNA特异性介导相同序列的mRNA降解,阻断相应基因表达。艾柏森生物提供的RAN干扰技术包括化学合成小RNA片段(SiRNA)和构建载体RNA(SnRNA)两种形式。实验委托者只需提供干预基因名称或基因序列ID,艾柏森生物免费设计合适的干预位点,保证至少有一对小RNA有效抑制目的基因表达,抑制效率不低于70%。


RNA干扰(SiRNA实验)流程
第一步 确定干扰基因,设计并合成合适的小干扰RNA(片段型或载体型小干扰RNA)。
第二步  预转染实验,进行细胞培养,摸索转染条件、时间并进行必要的检测(WB、PCR等),确定干预效果最佳的一对小RNA。
第三步  正式实验,设置合理实验分组,进行瞬时或稳定转染。
第四步  转染后检测,根据实验要求选择细胞生物学检测、蛋白检测、分子生物学检测等。以研究小干扰RNA对于细胞、蛋白或基因功能的影响。


RNA干扰(SiRNA实验)检测(可根据委托者实验需求选择做)
1。 细胞检测:细胞增殖毒性MTT、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移、细胞侵袭;
2. 蛋白检测:免疫印迹WB、免疫细胞化学ICC、免疫荧光IF、流式细胞术FCM、酶联免疫ELSIA;
3。 分子生物检测:RT-PCR、实时荧光定量PCR、甲基化特异性PCR(MSP);
4. 其他检测:生化检测、酶类检测、脂类检测、糖类检测。


实验案例: YYYY细胞在XXXX基因干扰后的增殖及侵袭能力实验
第一部分:实验细胞筛选
一、免疫荧光实验

实验试剂:PBS(磷酸盐缓冲液pH7。4),非免疫山羊血清,Triton X-100,BSA抗体稀释液,XXXX蛋白一抗 (1:100),二抗AlexaFluor 555 goat anti-rabbit IgG (H+L) *2 mg/mL*(A21428)
免疫荧光(IF)染色:倒出细胞培养液,PBS冲洗三次;2-4%甲醛固定15分钟;1×PBS缓冲液(0.01 M,pH7.4)洗涤3次,每次5分钟;滴加非免疫山羊血清(内含0.3%Triton X-100)封闭液,覆盖液面2-3mm,室温放置60min,甩去多余液体;滴加一抗plscr1 50μL(1:100),4℃过夜;PBS洗3次,每次5分钟;滴加荧光标记的上述二抗50μL(1:200),室温 60分钟;PBS洗3次各5min;荧光显微镜下观察、拍照,每指标照相2套图像。
IF染色结果(400倍): 通过荧光染色可以分析出,XXXX蛋白在YYYY细胞中表达量最突出。

YYYY细胞



AAAA细胞   


BBBB细胞


    

CCCC细胞



二、RT-PCR实验
实验材料:细胞样品4份,分组编号(见图片标示)
试剂:TrizolReagent,Invitrogen  Cat.NO.15596-026;ReverTraAce-α-TM  First Strand cDNA Synthesis Kit ,TOYOBO#FSK-100;PCR Master Mix(2x) Fermentas # K0172;DNA Marker DL2,000, TaKaRa D501A;0.1%DEPC水、氯仿(分析纯)、异丙醇(分析纯)75%乙醇;AGAROSE(琼脂糖)  AMRESCO,K499;10×DNA上样缓冲液, 美国ProMab,SJ-R2008523;0.5mg/ml EB 溶液,实验室常备;1×TBE, 实验室常备,配方参照《分子克隆实验指南 第二版》
仪器:PCR仪,ABI9600;电泳仪,北京六一仪器公司,DYCP-31DN型;高速离心机,湘仪H1650-W; 紫外分光光度计,上海江仪仪器有限公司,UV-7502C(751);成像系统,柯达紫外显相系统 400W像素
引物资料:
Homo- XXXX-F    5-cacccatgtctaccaaagtt -3,Homo-XXXX-R    5- ctctcaaaattccagtccag -3,片段长度: 175bp
Homo-GAPDH-F  5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3,Homo-GAPDH-R  5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3,片段长度   450bp
实验步骤:
1、RNA提取:每样本加入1mlTrizol试剂消化(组织约50mg—100mg充分剪碎,细胞约106—107);匀浆样品在室温静置5~10min后加入0.2倍体积的氯仿,震荡15秒后在2~8℃下12,000×g离心15min;将水样层转移至干净的试管,加入0.5倍体积的异丙醇,混匀后-20℃下静置10-15min,在2~8℃下12,000×g离心10min;移去上层悬液,将RNA沉淀用1ml 75%乙醇洗涤,在震荡器上混匀后2~8℃下7,500×g离心5min,弃去上清液;适度干燥RNA沉淀后,加入适量0.1% DEPC水,使RNA完全溶解;2000rpm离心20sec
2、总 RNA 定量:紫外分光光度计开机预热30 min;用蒸馏水洗涤石英比色皿,吸水纸吸干,加入DEPC水后,放入样品室的S池架上,关上盖板;设定紫外光波长(260nm、280nm)后校零(每次检测前均需调零);将待测样品适当稀释(RNA 1μl用DEPC水稀释至250μl)后,记录编号和稀释度;把装有稀释后待测样品的比色皿放进样品室的S架上,关闭盖板;分别测定260nm和280nm波长时的OD值(吸光度在0.1—0.5范围为最佳);用蒸馏水洗涤石英比色皿,酒精浸泡。
3、实验结果判断:纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白质、酚等污染) 纯RNA:OD260/OD280≈2.0(<1.7时表明有蛋白质或酚污染;>2.0时表明可能有异硫氰酸残存)

样本编号

稀释倍数

A260

A280

A260/A280

RNA浓度(ug/ul)

YYYY

250

0.348

0.179

1.944

3.48

AAAA

250

0.289

0。151

1.914

2.89

BBBB

250

0。302

0.159

1.899

3。02

CCCC

250

0.333

0。171

1。947

3.33


计算A260/ A280比值,比值≥1.8,满足实验要求。        
RT-PCR实验步骤:
产物用琼脂糖凝胶电泳检测:扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl(DNA样本8μl+上样缓冲液2μl) ,电压120V ,电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色约15分钟,清水漂洗后凝胶成像系统拍照。
凝胶图片与平均光密度值:阳性条带以Gelpro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD值。



点样说明及IOD参考值分析:

泳道

1

2

3

4

样品

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC

XXXX基因

15930

8099

10591

12963

R

0.603

0。325

0。438

0。545

泳道

5

6

7

8

样品

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC

GAPDH

26431

24934

24206

23786


R值为目的基因PLSCR1参考IOD值/内参基因GAPDH参考IOD值
XXXX基因在YYYY细胞中表达量最突出。


三、WB实验
实验试剂:XXXX蛋白多抗(1:400),37Ka;GAPDH单抗(1:1000),37Ka;RabbitAnti Goat IgG/HRP(1:30,000);GoatAnti mouse IgG/HRP(1:50,000)
WB操作流程:
实验结果:阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD(integrated optical density)累积光密度参考值。


Lanes:

Lane  1

Lane  2

Lane  3

Lane  4

Rows

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

XXXX

131.69

51.667

65.03

97.148

GAPDH

283.05

282.52

290.29

289。44

样本

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC


XXXX蛋白在YYYY细胞中表达量最高。
通过上述实验,确定有YYYY细胞来进行XXXX基因沉默实验最具意义。


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